IBS-ISBG

Mise à disposition d’expertises et d'instruments en biologie structurale, de l’échelle moléculaire à cellulaire, grâce à des approches de cristallographie aux rayons X, RMN, cryo-EM et spectroscopie.

Site de la plateforme

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IBS-ISBG

Une dizaine de plateformes de l’Institut de biologie structurale (IBS) sont regroupées au sein de l’Integrated structural biology Grenoble (ISBG). Elles offrent un catalogue de méthodes, d’expertises et d’instruments pour les projets de biologie structurale, de la production, purification et cristallisation des protéines, à leur caractérisation structurale, en passant par leur caractérisation biophysique et le contrôle qualité des échantillons.

Grâce à l’appui des équipes de recherche adossées, l’étendue des outils proposés couvrent l’étude des protéines, du clonage des gènes à la détermination de leur structure et à la compréhension de leurs mécanismes de fonctionnement.

Localisées sur le campus européen de Grenoble, les plateformes de l’IBS-ISBG bénéficient de la proximité de grands instruments de recherche, tels que les sources neutroniques de l’Institut Laue Langevin (ILL) et les installations du Synchrotron européen de Grenoble (ESRF), apportant une culture de l’accueil des visiteurs et de fortes expertises techniques.

Expertises et services

Spectrométrie de masse (MS) :

Analyse de protéines intactes et d’assemblages macromoléculaires,
Détermination de la masse exacte de protéines et de peptides à haute résolution,
Contrôle de l'expression, modification, mutation et marquage de protéines et peptides,
Analyse de la protéolyse à protéines limitées et de complexes macromoléculaires par spectrométrie de masse native.

Microscopie électronique (MET) :

Coloration négative : visualisation directe de protéines (50-100 kDa) et contrôle qualité,
Cryo-microscopie électronique, analyse d’image et tomographie : visualisation d’échantillons intacts, des interactions et implications biologiques,
Microscopie électronique cellulaire : étude morphologique de cellules, bactéries, tissus, localisation de protéines au niveau subcellulaire, suivi du cycle d’infection de virus…

Analyse structurale par RMN (RMN) :

Caractérisation de la structure et de la dynamique de complexes moléculaires,
Développement de molécules pharmacologiquement actives,
Caractérisation du degré de repliement de protéines,
Développement de méthodes de RMN liquide et solide pour des échantillons complexes,
Mise à disposition d’une librairie de méthodes d’analyse par RMN,
Adaptation de protocoles de marquage isotopique pour des protéines spécifiques ou de la production à grande échelle.

Imagerie cellulaire 4D (Imagerie) :

Mise à disposition d’un microscope confocal, d’un vidéo microscope et d’un cytomètre en flux pour l’étude de cellules vivantes (comptage et visualisation),
Analyse et traitement d’images.

Caractérisation biophysique (Biophysique) :

Réalisation de mesures d’affinité,
Caractérisation d’interactions biomoléculaires par des méthodes optiques de surface,
Analyse de vitesse et équilibre de sédimentation (ultracentrifugation analytique),
Développement de protocoles de contrôle qualité d’échantillons spécifiques.

Cell free expression (Cell Free) :

Production à grande échelle (mg) de protéines solubles, de protéines membranaires et d'ARNs en conditions sans RNAses,
Optimisation des conditions de réaction pour l'expression à grande échelle : criblage à petite échelle de l'expression de protéines et d'ARN.

Génération de bibliothèques aléatoires à évolution dirigée (ESPRIT) :

Création de bibliothèques de troncations et de mutagenèse ponctuelle, y compris au format co-expression,
Criblage robotisé pour l’identification et l’optimisation de constructions génétiques.

Cristallisation à haut débit de protéines membranaires (HTMPC) :

Cristallisation de protéines membranaires en phase lipidique (LCP),
Visualisation automatique d’images de gouttes de cristallisation en lumière visible et UV,
Récolte automatisée des cristaux cultivés en gouttes LCP.

Biologie moléculaire à haut débit et procédés biochimiques automatisés (RoBioMol) :

Clonage de gènes et mutagenèse dirigée,
Réalisation de test d'expression et de purification de protéines exprimées dans E. coli,
Criblage de détergents pour la solubilisation de protéines membranaires et purification par affinité.

Moyens et équipements

Spectrométrie de masse :

MALDI TOF/TOF MS Autoflex maX (Bruker Daltonics),
LC ESI-TOF MS 6210 (Agilent Technologies),
High Mass ESI Q-TOF MS Ultima (Micromass Waters).

Microscopie électronique :

Microscope FEI Tecnai 120 kV LaB6 avec caméras Orius 1000 et Orius 600 (Gatan),
Microscope en transmission FEI Tecnai F20 200 kV FEG avec caméra Ceta FEI 4kx4k (cryo et cryo-tomographie),
Microscope en transmission Glacios 200 kV FEG (Thermo Scientific) avec caméra à détection directe d’électrons (Falcon II), collecte automatique EPU et TEM Tomography (logiciel pour tomographie),
Instruments pour la préparation des échantillons : évaporateur de carbone, Glow Discharge, FEI Vitrobot (automate de congélation).

Analyse structurale par RMN :

950 MHz Bruker Avance III HD liquide/solide,
850 MHz Bruker Avance III HD liquide avec passeur d’échantillon,
700 MHz Bruker Avance III HD liquide/solide,
600 MHz Bruker Avance III HD liquide,
600 MHz Bruker Avance III HD liquide/solide,
600 MHz Agilent VNMRS liquide/solide,

Imagerie cellulaire 4D :

Microscope confocal S-M4D (Olympus et Andor),
Station d’imagerie d’épifluorescence V-M4D (Olympus, PerkinElmer),
Cytomètre VYB (Miltenyi Biotec),
Microscope de super-résolution PALM/STORM monté en kit à partir d’un IX81 (Olympus),
3 stations de travail pour l’analyse des données équipées des logiciels Volocity et Imaris pour la microscopie, MacsQuant et CellQuest pour la cytométrie.

Caractérisation biophysique :

Appareil de dichroïsme circulaire,
Fluorimètres Quanta Master QM-4 et Mini-Tau,
Appareil de diffusion dynamique de la lumière et de lumière laser multi-angle,
Calorimètre isotherme de référence (iTC200 et VP-ITC),
Appareil de thermophorèse microscopique (Monolith NT.115),
Appareil de résonance de surface plasma T200 (Biacore),
OctetRED96e pour biolayer interferometry,
Ultracentrifugeuse XLA/XLI (Beckman),
SEC-MALLS pour PAOL (protein analysis online).

Cell free expression :

Laboratoire de niveau L2 avec banc dédié, protocoles optimisés, extraits, enzymes et consommables maison cell-free mis à disposition.

Génération de bibliothèques aléatoires à évolution dirigée :

Robot de picking et gridding de colonies K3 (K Biosystems),
Incubateur à plaques HT (HiGro),
Scanner fluorescent Trio (Typhoon).

Cristallisation à haut débit de protéines membranaires :

Nanodistributeurs robotisés NT8 et Mosquito,
Systèmes d'imagerie automatisés Rock Imager 1000 et 1500 (Formulatrix) en lumière visible et UV,
Interface web CRIMS (crystallization information management system).

Biologie moléculaire à haut débit et procédés biochimiques automatisés :

Microlab Star Hamilton pour les procédés polyvalents de biologie moléculaire,
CFX Connect Bio-Rad pour les procédés RT-PCR et TSA.

<hr>Microscope électronique en transmission F20. © CEA, D. Morel.

<hr>Contrôle qualité par coloration négative. © CEA, D. Morel.

<hr>Microscopie électronique pour contrôle qualité. © CEA, D. Morel.

<hr>Cryo-microscope électronique Glacios (Thermo Fisher). © O. Cavoret.

<hr>Préparation d’échantillons pour la microscopie électronique cellulaire (ultramicrotome) © CEA, D. Morel.

<hr>Microscope confocal pour l’étude de cellules vivantes. © CEA, D. Morel.

<hr>Salle RMN à l’IBS de Grenoble. © CEA, D. Morel.

<hr>Préparation d’échantillons pour l’ultracentrifugation analytique (AUC) sur la plateforme de biophysique. © CEA, D. Morel.

<hr>Plateforme de cristallisation à haut débit de protéines membranaires (HTMPC). © CEA, D. Morel.

<hr>Plateforme de spectrométrie de masse structurale. © CEA, D. Morel.

<hr>Biologie moléculaire à haut débit sur la plateforme RoBioMol. © CEA.

Comment soumettre un projet ?

Les plateformes de l’IBS-ISBG réalisent des prestations et mettent leurs équipements à disposition des utilisateurs après formation, avec assistance et conseil. Tous les services font l’objet d’une facturation auprès du CNRS et diverses possibilités de financement existent : ERIC-Instruct et INext pour l’Europe, FRISBI et RMN-THC pour la France.

Les différents modes d’accès et les tarifs sont détaillés sur le site internet de l'ISBG. Pour soumettre une demande, vous pouvez envoyer un mail à l'adresse contact@isbg.fr ou bien directement à la plateforme de votre choix. Celle-ci vous aidera à définir votre projet et vous orientera vers une voie de financement appropriée.

Exemple d'utilisation

Elucidation de la structure de la polymérase du virus de La Crosse

Les polymérases des virus à ARN brin négatif segmenté (sNSVs) transcrivent et répliquent l'ARN viral dans une particule ribonucléoprotéique circulaire. Des chercheurs de Marseille et de Grenoble ont déterminé par cryo-EM et rayons X la structure de la polymérase du virus de La Crosse (LACV) de la famille des bunyavirus, donnant un aperçu à l’échelle atomique de la synthèse des ARNs chez les sNSVs.

Les expériences ont été réalisées sur les plateformes grenobloises de l’IBS-ISBG. Elles ont mis en œuvre la microscopie électronique, la spectrométrie de masse, le séquençage de protéines, le criblage ESPRIT, la cristallisation et l’expression cellulaire chez des insectes. Les résultats obtenus mettent en lumière une nouvelle approche pour la compréhension des mécanismes de réplication des sNSVs et ouvrent la voie au développement de médicaments dirigés contre ces virus très pathogènes pour l'Homme.

Pour en savoir plus : Gerlach P. et al. (2015). Structural insights into bunyavirus replication and its regulation by the vRNA promoter. Cell, 161(6):1267-79.