CEMIPAI

Accueil d’équipes, criblage antiviral et microscopie en milieu confiné pour l’étude et la pharmacologie des virus et bactéries pathogènes de classe 3.

Site de la plateforme

CEMIPAI

Accueil d’équipes, criblage antiviral et microscopie en milieu confiné pour l’étude et la pharmacologie des virus et bactéries pathogènes de classe 3.

Site de la plateforme

Centre d’études des maladies infectieuses et pharmacologie anti-infectieuse (CEMIPAI)

Le CEMIPAI met à la disposition des équipes de recherche en infectiologie l’un des plus vastes laboratoires confinés de niveau L3 de France. Il est organisé en huit modules indépendants entièrement équipés pour tout type d’expériences in vitro sur virus et microorganismes hautement pathogènes de classe 3. Les services de la plateforme et la location d’espaces L3 sont accessibles aux laboratoires publics et aux PME.

Le CEMIPAI propose par ailleurs des services de criblage à la carte pour la recherche de molécules antivirales, sous la forme de prestations de service, de collaborations ou de projets de recherche. Les expériences sont menées dans les installations de la plateforme par une équipe d’ingénieurs spécialisés dans la manipulation d’agents infectieux de classe 3.

Un plateau de microscopies en L3 complète le dispositif avec trois microscopes à fluorescence de dernière génération et de super résolution (TIRF/PALM, spinning disk), un système confocal Airyscan robotisé, ainsi qu’un microscope Bio-AFM couplé à la fluorescence. Unique en France, ce plateau de microscopies est optimisé pour l’imagerie d’échantillons vivants infectieux. Un support technique à l’imagerie et à la microscopie AFM est proposé. La plateforme est également un lieu de formation à l’expérimentation en laboratoire L3.

Expertises et services

Accueil, accompagnement et formation :

Accueil d’équipes et location de PSM ou de boxes L3 entièrement équipés,
Mise à disposition des équipements de la plateforme en autonomie après formation et accompagnement à la demande lors de séances assistées,
Formation théorique et pratique à l’expérimentation en L3,
Développement de formations à la carte pour les entreprises et académiques.

Criblage d’antiviraux :

Criblage de molécules, anticorps et chimiothèques sur des modèles de cellules en culture 2D (monocouches) et 3D (MucilAir, organoïdes) infectées par des virus sauvages ou exprimant un biomarqueur fluorescent,
Réalisation de tests en microplaques et évaluation de la robustesse statistique : tests en dose-réponse, tests de cytotoxicité, détermination de concentrations inhibitrices médianes (EC50) et quantification de la production virale (plages de lyse, RT-qPCR, fluorescence et luminescence),
Détection de sondes fluorescentes et biomarqueurs d’intérêt,
Réalisation de tests de seroneutralisation,
Criblage primaire et sélection des hits, criblage secondaire et validation des hits,
Réalisation d’études à façon : prise en charge intégrale de projets avec production d’un fichier de données et d’un rapport de résultats,
Développement de tests à la carte, y compris sur des modèles complexes, organoïdes et embryons de poisson zèbre,
Production de virus et bactéries de classe 2 et 3,
Cytométrie en flux sous PSM, acquisition et analyse des données.

Microscopie en milieu confiné :

Mise à disposition de vidéo-microscopes en contraste et fluorescence 4D, microscopie confocale Airyscan multicouleur automatisée à haut débit et microscopie de super résolution pour l’imagerie photonique subcellulaire et cellulaire, sur tissus, organoïdes et zebrafish,
Imagerie photonique de super résolution PALM sur microscope équipé d’un module TIRF,
Réalisation complète de projets de microscopie à force atomique couplée à la fluorescence, avec caractérisation topographique et analyse de propriétés mécaniques sur virus et bactéries de classe 3 et cellules vivantes infectées (contact, contact intermittent, spectroscopie de force),
Réalisation complète de projets de microscopie électronique incluant la préparation d’échantillons et leur observation (fixation, inclusion, coupe ultrafine, contraste et immunomarquage par méthodes conventionnelles),
Développement de technologies et méthodes d’imagerie en microscopie corrélative optique et AFM sur virus et bactéries de classe 2 et 3.

Moyens et équipements

Virologie et microbiologie de classe 3 :

Laboratoire de confinement L3 divisé en 8 boxes indépendants, constituant chacun un laboratoire de microbiologie autonome entièrement équipé avec 18 PSM de classe II, centrifugeuse, agitateur, incubateurs tri-gaz, congélateurs à -20°C, -80°C, -150°C, microscopes à épifluorescence et petits matériels,
Ultracentrifugeuses Optima L-80 XP et MAX-XP Biosafe (Beckman Coulter),
Cytomètre de flux NovoCyte 2100YBR sous PSM (Agilent),
Compteur de nanoparticules Videodrop (Myriade),

Criblage d’antiviraux :

Collections de cellules, virus pathogènes humains (VIH-1, SARS-CoV-2, chikungunya, zika, dengue, kunjin) et composés chimiques accessibles sous accord d’utilisation,
Criblage automatisé sous PSM de classe II : station de travail multicanaux Zephyr (PerkinElmer), bras distributeur Twister II (Caliper), hôtel incubateur de microplaques LiCONic STX44 (CyBio) et lecteur de microplaques Envision (PerkinElmer),
Lecture en absorbance, fluorescence (dont FRET) et luminescence (dont BRET) : technologie AlphaScreen (PerkinElmer), lecteurs et imprimante de codes-barres pour culture cellulaire,
Criblage par imagerie automatisée : microscopes à fluorescence automatisés avec contrôle environnemental ou par fluorescence de cellules vivantes sur plusieurs jours,
Préparation des échantillons : 3 laboratoires de biologie moléculaire et 3 salles de culture cellulaire L2.

Microscopie en milieu confiné :

Imagerie de super résolution PALM et N-STORM : microscope Ti-E (Nikon) avec module TIRF et contrôle environnemental,
Imagerie confocale à disque rotatif : microscope Axio Observer (Zeiss) avec spinning disk CSU-X1 (Yokogawa) et contrôle environnemental,
Imagerie automatisée à haut contenu et imagerie confocale à balayage laser : lecteur de plaques CellDiscoverer 7 (Zeiss) avec scanner LSM 900 Airyscan 2, optique adaptative et contrôle environnemental,
Imagerie quantitative par AFM et imagerie corrélative en fluorescence : microscope Bio-AFM JPK NanoWizard 4 (Bruker) avec scanner rapide et microscope à épifluorescence Ti-U (Nikon) avec contrôle environnemental,
Analyse d’images : 2 stations off-line.

<hr>Titration du SARS-CoV-2 par plages de lyse.

<hr>Image de microscopie à épifluorescence d’une plaque 96 puits avec cellules (rouge) infectées par le virus de la dengue (vert).

<hr>Image confocale de cellules pulmonaires (noyau en bleu) infectées par le SARS-CoV-2 (en orange).

<hr>Virus chikungunya observé en microscopie à force atomique en milieu liquide.

<hr>Expérience sous poste de sécurité biologique.

<hr>Image confocale d’un embryon de zebrafish infecté par le virus chikungunya (cellules infectées en magenta, vaisseaux en bleu).

<hr>Microscope Bio-AFM JPK NanoWizard 4 (Bruker) opérant en laboratoire L3 confiné.

<hr>Microscope de super résolution Ti-E (Nikon) avec module TIRF opérant dans le laboratoire L3.

<hr>Formation organisée avec CNRS-Entreprises sur l’expérimentation en laboratoire L3.

<hr>Ingénieur du CEMIPAI dans le laboratoire L3.

<hr>Bio-AFM JPK NanoWizard 4 (Bruker) au sein du laboratoire L3.

Comment soumettre un projet ?

La plateforme CEMIPAI est ouverte aux partenariats académiques et industriels. Elle intervient sous la forme de collaborations (co-financement, co-authoring, partage de propriété intellectuelle) ou de prestations de service (facturation du coût total, propriété intellectuelle au porteur de projet, co-authoring selon accord entre les parties). Les demandes et questions peuvent être adressées par mail à Nathalie Gros pour le criblage antiviral en L3 et la production de virus, Christine Chable-Bessia pour l’accueil et la formation en L3, ou Sébastien Lyonnais pour la microscopie.

Les nouveaux utilisateurs devront compléter et signer la charte du CEMIPAI et le règlement intérieur de la plateforme avant le début des expériences. Un formulaire de demande de projet, disponible sur demande à l’adresse contact@cemipai.cnrs.fr, permettra d’évaluer la faisabilité du projet. Le délai de traitement des échantillons est convenu en fonction des analyses souhaitées, du nombre d'échantillons et de l’activité de la plateforme au moment de la demande.

Exemple d'utilisation

Caractérisation de traitements antiviraux contre le SARS-CoV-2

Dès le printemps 2020, le CEMIPAI a mis au point des tests d’infection du SARS-CoV-2 sur différents systèmes cellulaires, permettant de développer rapidement des essais de criblage de potentielles molécules antivirales. Sollicitée par les médecins du CHU de Montpellier et l’IRD dans le cadre du repositionnement de drogues aux propriétés pharmacologiques déjà connues, la plateforme a exploré l’activité anti-SARS-CoV-2 de lactones macrocycliques, dont l’ivermectine, un antiparasitaire à large spectre récompensé par un prix Nobel en 2015.

Les ingénieurs du CEMIPAI ont réalisé leurs essais de criblage sur trois types cellulaires, dont des cellules pulmonaires Calu3 et des cellules A549 alvéolaires exprimant le récepteur humain ACE2, produites par transduction à partir d’un vecteur lentiviral. La souche virale a été amplifiée à partir d’une souche de SARS-CoV-2 isolée d’un patient du CHU Montpellier. Grâce à une combinaison d’approches mêlant plages de lyse et RT-qPCR, l’activité antivirale, la concentration inhibitrice médiane (EC50) et la toxicité cellulaire (CC50) ont pu être déterminées pour chaque drogue d’intérêt. Les activités antivirales ont ensuite été confirmées par microscopie confocale automatisée, permettant de quantifier l’inhibition d’évènements de fusion cellulaire induis par le SARS-CoV-2. En parallèle, une étude de microscopie à force atomique a été réalisée afin de mieux comprendre comment inactiver les particules virales. Ces travaux in vitro ont permis aux médecins de mieux cerner les limites de l’utilisation de l’ivermectine en milieu clinique.

Pour en savoir plus : Chable-Bessia C. et al. (2022). Low selectivity indices of ivermectin and macrocyclic lactones on SARS-CoV-2 replication in vitro. COVID, 2:60-75.